Sau khi về Thuỵ Điển, Nobel nghiên cứu về Nitroglycerin, một loại chất nổ phân giải ở 50-60 °C và phát nổ rất mạnh ở nhiệt độ 218 °C. Dù rất nguy hiểm, Nobel vẫn miệt mài nghiên cứu. Sau vài lần nghiên cứu với bố, anh cũng tìm ra nguyên lý của thuốc nổ và, mọi người đã chứng kiến một cách kinh ngạc. Nobel thành lập một công ty, và công ty của anh cũng làm ăn phát đạt hơn trước, không những thế, nhiều lúc nhà máy còn phải sản xuất cấp tốc để giao hàng cho kịp. Em út của Nobel, Emil Nobel cũng cùng anh và bố nghiên cứu Nitroglycerin, và Emil được quyền tự do trong nhà máy.

Nhưng do Alfred Nobel chủ quan về tính năng an toàn, ngày 3 tháng 9 năm 1864, nhà máy Nobel phát nổ, làm năm người thiệt mạng, trong đó có cả Emil, em Nobel. Sau lần tai nạn đó, thuốc nổ hầu như bị mọi người bác bỏ, nhưng Nobel quyết không từ bỏ ý định chế tạo thuốc nổ.